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Aug 16, 2023

La pangenómica del hongo de la muerte Amanita phalloides y de los Agaricales revela la evolución dinámica de los genes de las toxinas en un rango invasivo

The ISME Journal volumen 17, páginas 1236–1246 (2023)Cite este artículo 1709 Accesos 1 Citas 46 Detalles de Altmetric Metrics El venenoso hongo europeo Amanita phalloides (el “gorro de la muerte”) es

The ISME Journal volumen 17, páginas 1236–1246 (2023)Cite este artículo

1709 Accesos

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Detalles de métricas

El venenoso hongo europeo Amanita phalloides (el “gorro de la muerte”) está invadiendo California. Se desconoce si los metabolitos secundarios tóxicos de Death Caps están evolucionando a medida que invade. Desarrollamos un proceso bioinformático para identificar los genes MSDIN que sustentan la toxicidad y sondeamos 88 genomas de la capa de muerte de una población invasora de California y del área de distribución europea, descubriendo una diversidad previamente insospechada de MSDIN formada por elementos centrales y accesorios. Cada individuo de la capa de muerte posee un conjunto único de MSDIN y los genes de toxinas se diferencian significativamente entre las muestras californianas y europeas. Los genes MSDIN se mantienen mediante una fuerte selección natural, y el perfil químico confirma que los genes MSDIN se expresan y dan como resultado fenotipos distintos; Nuestro perfil químico también identificó un nuevo péptido MSDIN. Los genes de las toxinas están físicamente agrupados dentro de los genomas. Contextualizamos nuestros descubrimientos investigando MSDIN en genomas de todo el orden Agaricales, revelando que la diversidad de MSDIN se originó en expansiones de familias de genes independientes entre géneros. También informamos el descubrimiento de un MSDIN en una Amanita fuera del clado "letal Amanitas". Finalmente, la identificación de un gen MSDIN y su gen de procesamiento asociado (POPB) en Clavaria fumosa sugiere que el origen de los MSDIN es más antiguo de lo que se sospechaba anteriormente. La evolución dinámica de los MSDIN subraya su potencial para mediar en interacciones ecológicas, lo que implica a los MSDIN en la invasión en curso. Nuestros datos cambian la comprensión de la historia evolutiva de los hongos venenosos, enfatizando sorprendentes paralelismos con las toxinas animales evolucionadas de manera convergente. Nuestro proyecto proporciona una hoja de ruta para explorar metabolitos secundarios en otros basidiomicetos y permitirá la prospección de fármacos.

Una enorme literatura científica caracteriza los mecanismos ecológicos y evolutivos que permiten el éxito de los organismos introducidos en nuevos entornos [1, 2]. La investigación se ha utilizado para guiar la mitigación del daño ecológico y económico resultante de las invasiones biológicas [3]. Sin embargo, la biología de las invasiones se ha centrado principalmente en especies de plantas [4] y animales [5]. Gladieux et al. [6] especulan que las invasiones de hongos pueden ser más comunes que las de plantas o animales, lo que sugiere la naturaleza discreta de las investigaciones sobre los obstáculos a los hongos. Mientras tanto, los hongos invasores han devastado bosques [7], han llevado a varios anfibios y murciélagos al borde de la extinción [8, 9] y han causado enfermedades humanas [10]. Pero se sabe relativamente poco sobre las características que permiten el éxito de los hongos invasores no patógenos (mutualistas y descomponedores) en nuevos entornos.

Los metabolitos secundarios (SM) de los hongos, a diferencia de los metabolitos primarios, parecen mediar en las interacciones ecológicas [11]. Los SM son comunes en muchos hongos y dan forma a los nichos de las especies mediando en la competencia [12,13,14], influyendo en el rango de huéspedes [15, 16] y protegiendo contra factores estresantes ambientales [17,18,19]. Hasta hace poco se pensaba que los perfiles de SM definían especies, con relativamente poca o ninguna variación dentro de una especie, pero nuevos datos sugieren que las adaptaciones locales pueden manifestarse en patrones de diversidad de SM intraespecíficos específicos de la población [20]. Los SM específicos de una población influyen en los rangos geográficos de las especies e informan las inferencias macroevolutivas [20]. La mayoría de las investigaciones sobre SM de hongos se centran en los ascomicetos. Si bien los hongos son conocidos por su química, particularmente por su capacidad para causar alucinaciones y envenenamientos, las complejas historias de vida, la genética y los desafíos técnicos de la manipulación de los basidiomicetos han impedido el desarrollo de herramientas para catalogar la diversidad SM de los hongos y descripciones limitadas de su historia evolutiva.

El “gorro de la muerte” Amanita phalloides (Vaill. ex Fr.) Link es un basidiomiceto ectomicorrízico infame y venenoso nativo de Europa e introducido en otros lugares, incluso en América del Norte y, en particular, en California [21, 22]. Los hongos ectomicorrízicos pueden cambiar la dinámica competitiva entre especies de plantas [23], alterar la estructura de la comunidad del suelo [24], facilitar la homeostasis de los metales [25] e influir en el ciclo de los nutrientes [26]. Las posibles consecuencias ecológicas de la expansión del área de distribución del casquete mortal en California siguen siendo desconocidas, pero su abundancia [27] y los envenenamientos a menudo fatales asociados con su hongo [28] llevan a muchos autores a identificarlo como invasivo [29]. Los factores que contribuyen a la propagación y el éxito de los hongos ectomicorrízicos no nativos se han identificado basándose en modelos de sucesión primaria [30], pero aún no se ha investigado si las interacciones competitivas o defensivas con la biodiversidad nativa también facilitan la propagación. Las interacciones interespecíficas suelen estar mediadas por SM; en las plantas, los SM pueden tener efectos particularmente pronunciados en el rango invasivo de una especie, ofreciendo "armas novedosas" cuando compiten con organismos nativos "ingenuos" [31, 32]. Se desconoce si diferentes poblaciones de A. phalloides utilizan o explotan armas.

Se identifican algunos de los compuestos que sustentan la notoria toxicidad de A. phalloides, incluidos la α-amanitina, la faloidina y la falacidina [33]. Estas toxinas son constituyentes de una clase de SM descubierta recientemente denominada "MSDIN", basada en el motivo "líder" del aminoácido conservado Met-Ser-Asp-Ile-Asn. Los genes MSDIN codifican péptidos cortos (35–36 aminoácidos), sintetizados ribosomalmente y modificados postraduccionalmente (RiPP) [34]. Una prolil oligopeptidasa (POPB) específica de MSDIN escinde las porciones líder y “seguidora” conservadas de la proproteína MSDIN, lo que da como resultado un “núcleo” ciclado que se convierte en el producto final [35]. Si bien la ciclación de diversos péptidos centrales de MSDIN se ha demostrado mediante análisis químicos (p. ej., Zhou et al. [36]), la ciclación a menudo se infiere directamente a partir de datos de secuencia basados ​​en motivos líder y seguidor altamente conservados. Emblemática de la literatura SM, la investigación sobre MSDIN se ha centrado en identificar nuevas secuencias de diferentes especies utilizando un único o pequeño número de genomas de referencia; Se sabe poco sobre la diversidad de estos genes dentro de las especies. Hasta la fecha sabemos que el gen MSDIN que codifica la α-amanitina se distribuye de forma discontinua en Agaricales y se encuentra sólo en los géneros Galerina, Lepiota y Amanita [33]. Varios autores infieren la transferencia horizontal de genes para explicar la distribución discontinua de los genes MSDIN [33, 37]. Sin embargo, quedan dudas sobre la importancia relativa de la transmisión horizontal y vertical en la historia evolutiva de los genes (revisado por Walton [33]). La reciente identificación de genes adicionales involucrados en la biosíntesis de α-amanitina sugiere que una especie ancestral diferente, aún no identificada, también puede estar involucrada en los orígenes de los MSDIN [38]. Si bien la α-amanitina es el único MSDIN producido por las especies de Galerina [39, 40], la familia de genes MSDIN se ha expandido en el género Amanita, lo que ha dado como resultado docenas de MSDIN únicos que se encuentran en diferentes especies [34, 41,42,43]. Se supone que los MSDIN median la defensa contra insectos, nematodos y otros animales [33]. Sin embargo, la escasez de información sobre la diversidad intraespecífica de estos compuestos impide la experimentación ecológica específica necesaria para explicar la historia natural y la diversificación de los MSDIN en Amanita.

Buscamos establecer el potencial de los productos del gen MSDIN para dar forma a las interacciones en una población invasiva de California (CA) mediante el desarrollo de un proceso bioinformático para automatizar la identificación de los genes MSDIN, preguntando específicamente: (1) ¿Codifican cada uno los genomas de los individuos californianos de A. phalloides? el mismo conjunto de MSDINS, si no, ¿cómo está estructurado el pangenoma MSDIN y existen genes centrales y accesorios? (2) ¿Los genes de las toxinas se mantienen mediante la selección natural? (3) ¿La expansión de la familia de genes MSDIN es anterior a la especiación de Amanita spp. ¿Y cómo la expansión dio forma a la distribución física de los MSDIN dentro de los genomas? También utilizamos análisis químicos para confirmar la producción de productos MSDIN conocidos y buscar nuevos péptidos MSDIN, enfatizando que los productos del gen MSDIN se expresan y traducen, lo que da como resultado fenotipos y compuestos mensurables con el potencial de mediar en interacciones ecológicas.

Se tomaron muestras intensivas de hongos de A. phalloides de una única población invasora en Point Reyes National Seashore, CA, EE. UU. (n = 68) y de poblaciones nativas de toda Europa (n = 20), para un total de 88 genomas (Tabla S1). . Los hongos se recolectaron entre 1978 y 2015, y la mayor parte del muestreo se concentró en 2014 y 2015 (Tabla S1). También recolectamos hongos supuestamente identificados como Amanita thiersii y Amanita foetens en Kansas (A. thiersii) y Argentina (A. foetens), y utilizamos estos genomas en análisis comparativos y como controles. Numeramos los hongos recolectados del 1 al 90 (p. ej., 1mAP, 2mAP). Nuestros números corresponden a los números de AmanitaBASE utilizados en otras publicaciones generadas en el laboratorio Pringle [44] (Tabla S1). Se utilizó un solo hongo (7mAP; Tabla S1) con un ensamblaje de muy mala calidad en los escaneos iniciales de los genes MSDIN, pero se eliminó de los análisis posteriores (el ensamblaje de 7mAP estaba completo en un 10% según lo medido por BUSCO, y los siguientes ensamblajes más pobres de A. phalloides estaban completos en un 72,1, 91 y 92%, respectivamente).

Los ADN genómicos se extrajeron y secuenciaron utilizando una plataforma HiSeq2500 (Illumina) en modo rápido con lecturas finales emparejadas de 251 pb como lo describen Wang et al. [45]. También se secuenció un único aislado (72 mAP) con una plataforma PacBio RS II Sequel para lecturas largas (N50 = 6310 pb) y los datos se utilizaron para ensamblar el genoma de referencia [45]. Los SNP se denominaron (Wang et al. [45]) utilizando el proceso GATK [46] (Tabla S1), siguiendo las mejores prácticas (https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035535932-Germline- descubrimiento-de-variantes-cortas-SNP-Indels-). Luego, los SNP se filtraron exhaustivamente utilizando parámetros definidos en el flujo de trabajo GATK para organismos no modelo (https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035890471), específicamente: QD < 2,0 || FS > 60,0 || MC < 40,0|| MQRankSum < −12,5 || ReadPosRankSum < −8,0 para SNP; y QD < 2,0 || FS > 200,0 || ReadPosRankSum < −20,0 para indeles. Se identificaron hongos pertenecientes a la misma gineta (clones producidos por un solo individuo micelial) como se describe en Wang et al. [45]. En resumen: los clones se identificaron utilizando dos enfoques diferentes, el primero implicaba una matriz de distancia euclidiana resultante de SNP filtrados y el segundo se basaba en análisis de parentesco (Wang et al. [45]). Además, un único aislado (1mAP) procesado en trabajos anteriores, pero no utilizado debido a preocupaciones por una secuencia de baja calidad (que no fue evidente en nuestros esfuerzos), se corrigió por clonación en función de las relaciones filogenéticas identificadas aquí (Fig. 1). Ambos enfoques identificaron los mismos individuos genéticos o ginetas [45].

Las relaciones filogenéticas entre 38 especímenes de A. phalloides, una Amanita thiersii y una Amanita foetens se representan en un árbol de máxima verosimilitud construido utilizando SNP de todo el genoma. Los cuadros de colores indican la presencia de un alelo MSDIN definido por una secuencia "central" específica. Los loci que representan alelos, o grupos de alelos, en una ubicación física específica de un genoma están separados por columnas en blanco. Los recuentos superiores a uno son indicativos de loci duplicados que codifican alelos idénticos. En el genoma de referencia de alta calidad, validamos tres duplicaciones (ver Métodos complementarios), pero no pudimos validar duplicaciones en otros genomas y es posible que se produzcan errores de ensamblaje. Por esta razón, colapsamos los tres loci duplicados del genoma de referencia (*) para proporcionar congruencia con otras duplicaciones putativas (pero no resueltas). Si se infería una secuencia central a partir de datos de SNP, su valor de recuento se establecía en uno incluso si no se encontraba en el ensamblaje del genoma. La determinación de los "conocimientos" en la parte inferior de la figura se basa en informes anteriores de secuencias principales de MSDIN o caracterización de productos químicos. Los nombres de locus (en texto negro) se basan en el alelo presente en el conjunto del genoma de referencia (ver 72mAP en negrita). El nombre de un único locus que no se encuentra en el genoma de referencia (FILAPIIP) se eligió alfabéticamente. El panel encima del mapa de calor indica las diferencias en las frecuencias alélicas entre los individuos californianos (en rojo) y europeos (en naranja). Las diferencias significativas en las frecuencias alélicas en cada locus se basan en el análisis de varianza molecular. Los loci AFPHFYVPP, FFPIVFSPP, FIFPPFFIPP y SFFFPIP no se incluyeron en los análisis de frecuencia de alelos debido a la incertidumbre en algunas llamadas (ver Resultados). † Estas secuencias MSDIN están asociadas con productos maduros con bioactividad caracterizada como toxinas. De izquierda a derecha: falacidina (AWLVDCP), faloidina (AWLATCP), β-amanitina (IWGIGCDP) y α-amanitina (IWGIGCNP).

Los adaptadores y las secuencias de baja calidad se eliminaron de las lecturas sin procesar utilizando BBMap v38.32 [47]. Las lecturas recortadas se ensamblaron utilizando SPAdes v3.5.0 [48]. Los intentos de anotar los genes MSDIN en los genomas utilizando el software existente fracasaron, incluso cuando los anotadores de genes fueron entrenados en conjuntos de MSDIN conocidos. Por lo tanto, desarrollamos nuestra propia línea para identificar nuestros genes de interés.

Para identificar secuencias de MSDIN en ensamblajes de genomas, creamos un proceso bioinformático personalizable. Las inferencias resultantes de presencia/ausencia de MSDIN a partir de datos de ensamblaje se validaron en función de los datos de alineación, como se describe a continuación. Brevemente, se utilizó un conjunto de secuencias MSDIN conocidas en una búsqueda inicial de genomas con tBLASTn [49] (Tabla S2). Los hits con valores e inferiores a 100, un límite consistente con un estudio publicado [43], se tradujeron en todos los marcos de lectura y se escanearon en busca de motivos similares a MSDIN utilizando MAST entrenado en motivos de líder y seguidor identificados con MEME [50]. Las proteínas en las que se encontraron motivos de secuencia líder aguas arriba de los motivos seguidores y en las que MEME determinó un valor e inferior a 100 se conservaron para análisis posteriores. Se identificaron todos los intrones posibles (incluidos los intrones GC-AG no canónicos) y las proteínas resultantes se filtraron según las características conocidas de los genes MSDIN (como lo detalla Walton [33]; Métodos suplementarios). Nuestro canal se compone de una serie de scripts independientes y fácilmente personalizables disponibles en los Materiales complementarios. Nuestra cartera encuentra todos los genes MSDIN previamente identificados en genomas bien estudiados (ver Métodos complementarios).

Sin embargo, como estrategia para permitir la identificación de nuevos MSDIN, elegimos parámetros de canalización bioinformática de modo que también se incluyeran secuencias "similares a MSDIN" en los resultados. Finalmente, excluimos de análisis posteriores tres secuencias similares a MSDIN encontradas en los genomas de Agrocybe cylindracea (el nombre de esta especie se conserva para mantener la coherencia con el NCBI, pero ahora se conoce como Cyclocybe cylindracea) y Mycena clorofos. Estas secuencias se ubicaron en el valor de corte mínimo de nuestra tubería y las relaciones filogenéticas con la secuencia MSDIN conocida y la falta de POPB en los genomas correspondientes sugieren que, de hecho, no son MSDIN (Resultados complementarios; Fig. S1).

Para evitar problemas asociados con errores de ensamblaje o fragmentación, todas las llamadas de presencia/ausencia de MSDIN se validaron mediante métodos basados ​​en alineación. Los archivos generados por nuestra canalización MSDIN identifican regiones MSDIN en genomas objetivo, lo que nos permite subconjuntos de datos de alineación. Alineamos las lecturas de todos los genomas de A. phalloides con el genoma de referencia utilizando BWA MEM [51]. La profundidad de lectura en los loci MSDIN se determinó utilizando BEDTools [52]. Para alineamientos sin eliminaciones a gran escala, reinsertamos indeles y SNP (de Wang et al. [45]) en las secuencias del genoma de referencia utilizando SAMTools faidx [53] y vcf-consensus de VCFTools [54]. Luego se compararon las secuencias resultantes de la reinserción de SNP/indeles con los resultados del ensamblaje. En los casos en los que la presencia de un MSDIN estaba fuertemente respaldada por los datos de alineación pero la secuencia no se ensambló, inferimos un error de ensamblaje e inferimos los MSDIN directamente a partir de los resultados de la alineación. Cuando se encontraron discrepancias entre los resultados de alineación y ensamblaje, visualizamos alineaciones relevantes junto con alineaciones no afectadas utilizando IGV [55]. Las discrepancias entre los datos de ensamblaje y alineación se explicaron con mayor frecuencia por la aparición de SNP heterocigotos que dieron como resultado dos posibles secuencias MSDIN donde SPAdes [48] solo ensamblaba un alelo. En un pequeño subconjunto de loci, múltiples SNP heterocigotos no fueron eliminados mediante software de llamada de variantes (es decir, no asociados con uno u otro cromosoma homólogo en el dicarión). En estos casos, confirmamos manualmente la fase de SNP mediante la visualización de todas las alineaciones (corregidas por clonación), nuevamente usando IGV [55].

Cuando un locus MSDIN no estaba presente en el genoma de referencia, alineamos las lecturas de todos los genomas con el genoma con el nuevo MSDIN y el ensamblaje de mayor calidad (según lo determinado por la puntuación BUSCO). En estos casos, examinamos el lugar como se describe anteriormente. Sin embargo, como estos casos eran raros, los SNP no se volvieron a llamar y, en cambio, las variantes se infirieron manualmente mediante la visualización de los datos de alineación en IGV [55]. En casos raros, observamos desalineación de lecturas entre loci muy relacionados, generalmente cuando un locus correspondiente en un aislado alineado no estaba presente en la referencia.

La reinserción de SNP en el genoma de referencia proporcionó pruebas sólidas de que los MSDIN coexisten en el mismo locus. La estructura del locus se validó aún más mediante alineamientos de contigs a gran escala (detallados en Métodos complementarios). El locus AFPHFYVPP no se ensambló en el genoma de referencia de lectura larga, pero fue evidente en su ensamblaje utilizando solo lecturas cortas (72 mAP). Los loci normalmente se denominaban según los alelos encontrados en el genoma de referencia. Sin embargo, el locus FILAPIIP no se encontró en el genoma de referencia y su nombre se eligió alfabéticamente.

La agrupación física de MSDIN se evaluó mediante una expresión binomial para evaluar la distribución de MSDIN. Además, realizamos una prueba de permutación para comparar las distancias observadas entre los loci MSDIN con una distribución aleatoria, como se detalla en los Métodos complementarios. Las correlaciones entre las distancias físicas y genéticas se calcularon con la prueba de correlación de Pearson implementada en R. Visualizamos la distribución de MSDIN entre individuos de A. phalloides utilizando los paquetes R ggplot2 [56], ggtree [57] y ggtreeExtra [58].

Para proporcionar un contexto filogenético a nuestros resultados, descargamos los 249 genomas de Agaricales (que representan 163 especies) disponibles del NCBI el 22 de noviembre de 2021 (Tabla S3). Se identificó en todos los genomas un conjunto de ortólogos de copia única conservados en hongos (OrthoDB v9) utilizando BUSCO [59]. Alineamos secuencias BUSCO usando MAFFT v7.475 [60] con la configuración "-auto". Las alineaciones resultantes se recortaron usando trimAl v1.2 con el parámetro "-automate1" y se usaron para construir árboles de máxima verosimilitud con IQ-TREE v1.6.2 [61] después de probar el modelo de mejor ajuste usando el parámetro "-mset" restringido dentro de modelos compatibles con RAxML. Según corresponda, el arranque se realizó en IQ-TREE utilizando 1000 réplicas de la aproximación de arranque ultrarrápido. Con ASTRAL se infirió una filogenia consensuada de los árboles BUSCO [62]. Utilizamos un gráfico UpSet generado con UpSetR [63] para comparar las secuencias centrales de MSDIN entre especies, agregando datos de Luo et al. [38] para identificar diferencias y superposiciones (Tabla S2 y S4). Establecimos relaciones filogenéticas entre los aislados de A. phalloides, A. thiersii y A. foetens utilizados aquí a partir de datos de SNP bialélicos filtrados que se diluyeron para que ningún SNP estuviera a menos de 1 kb utilizando VCFtools [54]. Este subconjunto de SNP se procesó utilizando IQ-TREE como se describe anteriormente.

Los genes POPB codifican una enzima necesaria para la modificación postraduccional de las proproteínas MSDIN, y para identificarlas obtuvimos un conjunto de secuencias de proteínas POPB y POPA (POPA es un gen estrechamente relacionado que no afecta la maduración de MSDIN) del NCBI (Fig. .S2 y Tabla S5). Utilizamos tBLASTn para identificar regiones objetivo en todos los genomas de Agaricales, basando la identificación en todos los aciertos (incluidos los alineamientos muy cortos) con valores e inferiores a 0,01. Extrajimos los 6 kb que flanquean cada lado de cada golpe (12 kb en total; menos si nos topamos con el final de un contig asociado) usando SAMtools faidx [53]. Identificamos genes candidatos en regiones objetivo utilizando AUGUSTUS v3.4.0 [64] con modelos de genes de Laccaria bicolor prediseñados y utilizando señales de proteínas de secuencias conocidas de POPA y POPB (Tabla S5). Todas las proteínas encontradas en las regiones objetivo se consultaron nuevamente con secuencias conocidas de POPA y POPB utilizando BLASTp. Se analizaron los 10 resultados principales de POPA y POPB (ordenados por puntuación de bits y según disponibilidad, un máximo de 20 secuencias) de cada genoma: estas secuencias de proteínas se alinearon con secuencias conocidas de POPA y POPB usando MAFFT, recortadas usando trimAl y relaciones filogenéticas. entre ellos se determinaron utilizando IQ-tree, como se detalla anteriormente. Las filogenias resultantes se inspeccionaron manualmente y se infirió la presencia de POPB cuando una secuencia candidata formó un clado monofilético con otras secuencias de POPB conocidas.

Con base en datos bioinformáticos preliminares, se seleccionaron tres especímenes de A. phalloides europeos (5mAP, 9mAP y 29mAP) y tres californianos (21mAP, 23mAP y 75mAP) para representar la mayor diversidad de MSDIN posible. Se trituró una pequeña muestra de cada hongo seco hasta obtener un polvo fino. Cada muestra se extrajo con 10 ml de metanol al 100% y se pasó a través de papel de filtro. Los extractos se redujeron a sequedad en aire, se pesaron y se resuspendieron en metanol al 100% a una concentración final de 1 mg/mL.

UHPLC-HRMS se realizó en un sistema Thermo Scientific Vanquish UHPLC conectado a un espectrómetro de masas Thermo Scientific Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap operado en modo de ionización positiva. Se utilizó una columna Waters Acquity UPLC BEH-C18 (2,1 x 100 mm, 1,7 μm) con acetonitrilo (0,1 % de ácido fórmico) y agua (0,1 % de ácido fórmico) a un caudal de 0,2 ml/min. Se implementó un método de gradiente de detección de la siguiente manera: comenzando con 10 % orgánico durante 5 min, seguido de un aumento lineal hasta 90 % orgánico durante 20 min, otro aumento lineal hasta 98 ​​% orgánico durante 2 min, manteniendo 98 % orgánico durante 5 min. , disminuyendo nuevamente al 10% orgánico durante 3 minutos y manteniéndose al 10% orgánico durante los últimos 2 minutos, para un total de 37 minutos. Se inyectaron diez microlitros de cada muestra en el sistema para el análisis. Se identificaron tres toxinas MSDIN bien conocidas, α-amanitina, faloidina y falacidina, comparando perfiles con estándares adquiridos de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, EE. UU.). La cuantificación absoluta de estos tres compuestos se calculó en relación con una curva estándar (0,1–10 ppm).

Los análisis genéticos de población utilizaron un conjunto de datos corregidos por clones para identificar patrones demográficos. Calculamos las estadísticas de diversidad y D de Tajima en ventanas de 500 pb a partir de datos de alineación utilizando el paquete PopGenome R [65]. La diferenciación del contenido del gen MSDIN entre Europa y California se calculó con el Análisis de VArianza MOlecular (AMOVA) en GENALEX [66]. El aislamiento genético entre muestras europeas y californianas se validó aún más mediante el análisis discriminante de componentes principales (DAPC) ejecutado en el paquete poppr R [67].

Para medir las proporciones dN/dS, alineamos secuencias de nucleótidos MSDIN usando MAFFT y construimos filogenias con IQ-TREE usando los parámetros descritos anteriormente. Las alineaciones de secuencias se reformatearon utilizando Pal2Nal [68]. Luego estimamos una única relación dN/dS en filogenias completas utilizando PAML [69].

Nuestro proceso bioinformático de búsqueda de MSDIN y la posterior validación manual identificaron 2940 secuencias de MSDIN de 88 genomas de A. phalloides (Tabla S1) que representan 43 secuencias de aminoácidos de MSDIN únicas (según lo definido por la región central de MSDIN que se convierte en el péptido maduro) (Tabla S2 ). Trece de las secuencias únicas de MSDIN son nuevas (Fig. 1; Tabla S2). Dos de estas nuevas secuencias (FLPPFLP e IWGKGCDP) se encontraron en un solo individuo y no están claramente asociadas con un locus específico; excluimos a ambos de análisis adicionales. Utilizando la corrección de clones, colapsamos genomas idénticos o casi idénticos en un solo punto de datos [45]. En el conjunto de datos corregido por clonación identificamos un total de 1308 secuencias MSDIN en 38 individuos de A. phalloides (Fig. 1). El número de secuencias MSDIN únicas encontradas en estos 16 individuos europeos y 22 californianos osciló entre 25 y 32 con una mediana de 29. El pangenoma MSDIN de A. phalloides comprende 15 genomas centrales (que se encuentran en todos los aislados) y 26 genomas accesorios (que se encuentran en todos los aislamientos). sólo en algunos aislados) MSDIN. Se encontraron dos de los MSDIN del genoma accesorio en todos los individuos menos en uno (Fig. 1). Los genomas ensamblados estaban completos en un 94,1% en promedio, pero estaban fragmentados en un promedio de 42.500 cóntigos (Tabla S1). La cantidad de MSDIN encontrada no se correlacionó positivamente con la integridad de los genomas (Fig. S3).

Las 41 secuencias MSDIN únicas se asignaron a 31 loci distintos. Cada locus codifica de uno a tres alelos (Fig. 1). Treinta de estos loci se encontraron en el genoma de referencia (Tabla S6). Nombramos loci según el alelo presente en el conjunto del genoma de referencia (ver texto negro en la parte inferior de la Fig. 1; Métodos complementarios). Se encontraron tres MSDIN, IWGIGCDP (β-amanitina), AWLATCP (faloidina) y LIQRPFAP (no caracterizado), cada uno en dos loci distintos (duplicados) en el genoma de referencia. Sin embargo, los ensambladores del genoma que utilizamos normalmente colapsan alelos idénticos en una secuencia única. De hecho, incluso los alelos estrechamente relacionados (pero diferentes, es decir, heterocigotos) a veces sólo eran evidentes a partir de los datos de SNP. Por el contrario, es posible que la variación de secuencia cerca de MSDIN en núcleos dicarióticos cause que dos secuencias idénticas del mismo locus aparezcan en conjuntos como dos alelos distintos. Si bien pudimos validar duplicaciones de IWGIGCDP, AWLATCP y LIQRPFAP en el genoma de referencia de alta calidad (ver Métodos complementarios), no fue posible validar duplicaciones de otros MSDIN en otros genomas. Por estas razones, elegimos un enfoque conservador y colapsamos estos tres loci duplicados, enfatizando que la presencia de más de una copia de un alelo en un conjunto (es decir, el "recuento" de una secuencia específica) sugiere una duplicación no resuelta ( Figura 1).

Además, los loci FFPIVFSPP y FIFPPFFIPP están físicamente muy juntos y a menudo parecen codificar los mismos alelos, lo que genera preocupación sobre el mapeo no específico de datos. Ocasionalmente se observó una alineación no específica de las lecturas de AFPHFYVPP cuando se alineó con el genoma de referencia porque en el genoma de referencia falta este locus (consulte Métodos complementarios). De manera similar, una duplicación del locus SFFFPIP que no está presente en la referencia generó preocupaciones sobre nuestra capacidad para resolver secuencias SFFFPIP (ver aislados con recuentos de tres alelos, Fig. 1). Para evitar errores de interpretación asociados con estas duplicaciones supuestamente no resueltas, no incluimos FFPIVFSPP, FIFPPFFIPP, AFPHFYVPP o SFFFPIP en análisis adicionales. Si bien nuestros resultados comienzan a desentrañar la estructura del locus de los MSDIN, serán necesarias tecnologías emergentes de lectura larga para resolver completamente estas secuencias estrechamente relacionadas.

Las colecciones de California y Europa son genéticamente distintas, lo que sugiere que ningún sitio europeo muestreado aquí es la fuente de los límites de muerte invasores que tomamos en California (Fig. S4). Para aclarar si las diferencias en las frecuencias de los alelos del genoma accesorio entre especímenes nativos e invasivos reflejan diferentes historias evolutivas, utilizamos AMOVA para probar la partición significativa de la varianza genética en los loci MSDIN. La frecuencia de los alelos MSDIN se diferenció significativamente en todos los loci (p = 0,001, ΦPT = 0,31). Las comparaciones individuales identificaron cuatro loci significativamente diferenciados (p <0,005 después de la corrección de comparación múltiple), cada uno de los cuales tiene ΦPT > 0,24 (Fig. 1). Las secuencias centrales IFLVFPIPP, LPILPIPPLP, GVILIIP, GFFFPPFFFPP y FFLIVFFPP solo se encuentran en especímenes europeos. De acuerdo con los posibles efectos fundadores en la población invasora de California, ninguna secuencia de MSDIN es exclusiva de California. Sin embargo, algunos alelos se encuentran con mayor frecuencia en California; por ejemplo, el alelo IVGILGLP del locus IIGILLPP es el alelo dominante en California, pero es relativamente raro entre los especímenes europeos (consulte el gráfico de barras en la parte superior de la Fig. 1). Es poco probable que Europa sea una única población panmíctica [21], y se necesitan más recopilaciones para aclarar cómo las frecuencias de los alelos MSDIN en el rango invasivo han cambiado en relación con las poblaciones de origen actualmente desconocidas dentro de Europa.

Los péptidos MSDIN son conocidos por la extrema toxicidad de algunos péptidos comunes y/o sus derivados. Las toxinas letales incluyen α-amanitina (IWGIGCNP), β-amanitina (IWGIGCDP), faloidina (AWLATCP) y falacidina (AWLVDCP) [33]. Los genes que codifican estos péptidos son constituyentes altamente conservados del pangenoma (Fig. 1). Los perfiles LC-MS/MS de seis extractos demuestran claramente que cada uno de los hongos correspondientes había sintetizado α-amanitina, faloidina y falacidina, aunque las cantidades relativas diferían entre las muestras (Fig. S5). Se desconoce si las diferencias genéticas entre los hongos impactan la variación en la producción de toxinas, pero las variables ecológicas y de desarrollo sí contribuyen a las cantidades de toxinas encontradas en los esporocarpos (revisado por Walton et al. [33]). También se identificó un producto MSDIN químicamente no descrito, la cicloamanida G (GFFPPFFFPP), en los extractos del hongo 5mAP muestreados en Italia (Fig. S6). Esta secuencia coincidía exactamente con un gen accesorio recientemente identificado (Fig. 1). Por simplicidad y coherencia con trabajos anteriores [33], nos referimos a todos los compuestos MSDIN con biogénesis común como "cicloamánidas", aunque las modificaciones postraduccionales a veces colocan productos MSDIN maduros en diferentes clasificaciones químicas.

Las comparaciones de MSDIN entre géneros y dentro de A. phalloides revelan que se están seleccionando genes de toxinas. La fuerte selección purificadora que actúa sobre la secuencia central de α-amanitina es evidente en las comparaciones entre géneros (Fig. 2). Dentro de A. phalloides, las regiones líder y seguidora altamente conservadas también sugieren una selección purificadora, mientras que las regiones centrales altamente variables pueden reflejar una selección diversificada (Fig. 2). No podemos descartar una evolución neutral como motor de diversificación en la región central del MSDIN porque sus sitios informativos estaban saturados en todos los alineamientos. No probamos la selección que actúa sobre secuencias centrales individuales de MSDIN dentro de A. phalloides porque las proporciones dN/dS no son confiablemente monótonas dentro de las especies (revisado por [70]). La selección también se puede inferir a partir de métricas a nivel de población del espectro de frecuencia del sitio. Sin embargo, nuestra estrategia de muestreo se centró en contextualizar la diversidad de una única población californiana dentro de la amplitud de la diversidad europea. Debido a las diferencias en el muestreo entre California y Europa, dudamos en interpretar las estimaciones de D de Tajima asociadas con loci MSDIN específicos que se encuentran dentro de ventanas individuales de 500 pb (aunque presentamos estos valores en los Resultados complementarios y en la Fig. S7). Se necesitan estudios futuros diseñados específicamente para abordar los patrones de selección para ofrecer evidencia sólida de las tendencias que identificamos en loci individuales. Los patrones de todo el genoma en la distribución de todas las ventanas corredizas muestran un cambio positivo en la distribución de Tajima's D en la población de California. El cambio puede indicar la pérdida de alelos raros después de un evento fundador y sugerir que no ha habido tiempo suficiente para que el crecimiento de la población recupere los alelos raros. Una mediana cercana a cero de la D de Tajima de muestras europeas es consistente con el equilibrio genético. La distribución de las mediciones D de Tajima en todo el genoma (Fig. S7) respalda la historia natural de una población introducida en California y una población europea nativa, aunque no se pueden descartar por completo las influencias demográficas y relacionadas con el muestreo (por ejemplo, muestreo desigual en estructuras de población no realizadas). puede dar como resultado cambios positivos en la D de Tajima, una explicación que consideramos poco probable para nuestro muestreo geográficamente limitado en California (Fig. S7, Resultados complementarios) [21].

Las letras más grandes en el logotipo de la secuencia corresponden a una mayor frecuencia del residuo de aminoácido específico en un sitio determinado. Inferimos que la selección actúa en las partes líder, central y seguidora de MSDIN y en secuencias completas utilizando proporciones dN/dS (que se muestran arriba de los logotipos) calculadas en PAML. No pudimos medir la selección que actúa sobre las secuencias centrales de A. phalloides (abajo, en el medio) porque los sitios informativos están saturados en esta región altamente diversificada.

Las secuencias de MSDIN poseen un número muy bajo de codones efectivos en relación con otros genes en el genoma de referencia de A. phalloides (Fig. S8), y una hipótesis sugiere que la selección que actúa sobre los genes MSDIN ha optimizado los codones de MSDIN [71]. Sin embargo, los patrones en los genes MSDIN no reflejan consistentemente patrones de sesgo de codones en todo el genoma (Fig. S8) y sugerimos que puede haber otras explicaciones. El uso diferencial de codones puede permitir la corregulación de genes [72] y puede contribuir a la diversidad de las secuencias de aminoácidos resultantes al aumentar las tasas de mutación [73]. Esta última función se ha sugerido para los péptidos cíclicos de los venenos del caracol cono [74]. Se necesita más trabajo para aclarar la importancia del uso de codones en secuencias MSDIN.

Documentar la distribución física de los MSDIN resultantes de las expansiones de la familia de genes MSDIN en Amanita spp. Primero utilizamos ventanas de 100 kb para escanear el genoma de referencia de A. phalloides. Identificamos dos ventanas que contienen dos loci MSDIN cada una, tres ventanas que contienen tres loci cada una y dos ventanas que contienen seis loci cada una (Tabla S6). En general, los loci MSDIN están físicamente agrupados (expresión binomial, p <0,000001). Comparamos la distancia media observada entre los loci MSDIN con una distribución aleatoria y los loci MSDIN confirmados están significativamente más cerca entre sí de lo que puede explicarse por probabilidad aleatoria (p <0,001) (Fig. 3). Además, las secuencias MSDIN codificadas en loci físicamente agrupados están más estrechamente relacionadas entre sí que con secuencias en loci más distantes, es decir, encontramos una correlación significativa entre las distancias genéticas y físicas utilizando ambas secuencias de codificación completa (p < 0,001 r = 0,6) y las secuencias de intrones solas (p = 0,002, r = 0,49) (Fig. 3).

un árbol de máxima verosimilitud que representa las relaciones genéticas entre las secuencias centrales de MSDIN de cuatro géneros determinadas a partir de secuencias completas, incluido el intrón. El árbol tiene sus raíces en el hongo de divergencia temprana, Clavaria fumosa, para reflejar las relaciones conocidas entre especies. Se incluyen valores de soporte de Bootstrap para un subconjunto de nodos para enfatizar que las topologías dentro del clado que contiene Amanita spp. Los MSDIN no están completamente resueltos. Algunas Amanita spp. se han omitido por motivos de legibilidad. En la Fig. S9 se presenta un conjunto completo de valores de arranque en los MSDIN de todas las especies. Las puntas están codificadas por colores para que coincidan con b Un ejemplo de una sola región que codifica múltiples loci MSDIN que están colocalizados en los genomas de A. phalloides y A. subjunquillea. c El análisis de permutación de distancias físicas entre loci MSDIN en A. phalloides indica que la distancia observada entre MSDIN (rojo) es significativamente menor que una distribución nula (azul) (p <0,001 como lo indica la línea discontinua). d Las distancias genéticas de las secuencias completas de codificación MSDIN (izquierda) o intrón (derecha) se correlacionan significativamente con las distancias físicas (para la prueba de correlación p < 0,001 r = 0,6, p = 0,002, r = 0,49, respectivamente; para las líneas de mejor ajuste R2 = 0,414 y R2 = 0,349, respectivamente).

Los loci MSDIN de otras especies también están físicamente agrupados. En Lepiota venenata, dos nuevas secuencias MSDIN (ver más abajo) se encuentran a una distancia de 5 kb entre sí. Cinco contigs en A. bisporigera codificaron cada uno dos o más loci MSDIN dentro de 15 kb, aunque nuestra capacidad para mapear loci MSDIN en este genoma se vio obstaculizada por una extensa fragmentación de secuencia. En el genoma de Amanita subjunquillea de alta calidad, identificamos cuatro regiones genómicas con loci físicamente agrupados, incluida una región que codifica cinco MSDIN dentro de ~ 13 kb. La alineación de los ensamblajes de A. subjunquillea y A. phalloides reveló que esta región es ortóloga a una región de ~ 25 kb en el genoma de referencia de A. phalloides que codifica seis loci MSDIN (Fig. 3). En esta región, el locus IRLPPLFLPP de la referencia de A. phalloides falta en el genoma de A. subjunquillea. Al menos uno de los dos alelos en este locus está presente en todos los aislados de A. phalloides (Fig. 1). Siguen siendo preguntas abiertas si existe una variación intraespecífica en la presencia de este locus en A. subjunquillea, si se ha perdido en A. subjunquillea o si evolucionó en A. phalloides después de la divergencia de estos dos linajes.

Análisis filogenético de secuencias MSDIN de Amanita spp. y Lepiota sugiere una historia evolutiva dinámica. Si bien las secuencias codificantes pueden estar sujetas a selección, las secuencias de intrones de MSDIN son demasiado cortas (52-58 pb) para brindar una resolución filogenética confiable, por lo que optamos por utilizar secuencias de extremo a extremo que incluyan tanto secuencias codificantes como intrones. En esta filogenia, los MSDIN de diferentes géneros formaron grupos discretos (Figs. 3 y S9), lo que sugiere que las expansiones de la familia de genes ocurrieron de forma independiente en cada género. Las secuencias agrupadas de α-amanitina de L. venenata y G. marginata son la única excepción al patrón general.

Los genomas de todos los hongos productores de MSDIN codifican dos enzimas prolil oligopeptidasa (POP). El primer gen, POPA, puede estar ampliamente distribuido en Agaricales y se cree que funciona como un gen proteolítico de mantenimiento (una hipótesis sugerida por Walton [33]). Sin embargo, las prolil oligopeptidasas encontradas entre Agaricales spp. puede no ser ortólogo [37]. El segundo gen, POPB, anteriormente solo se había encontrado en especies productoras de MSDIN, donde es necesario para la maduración de la proproteína MSDIN. Confirmamos ortólogos de POPB en todos los genomas disponibles de especies productoras de MSDIN previamente identificadas (Fig. 4). También identificamos un ortólogo de POPB en el genoma de Amanita polypyramis (Fig. 4), la primera vez que se encuentra un gen POPB dentro del género Amanita pero fuera del clado monofilético de las "Amanitas letales" [33]. Además, descubrimos un gen POPB en Clavaria fumosa, un hongo de Agaricales de divergencia temprana. El análisis filogenético confirmó la identidad tanto de POPA como de POPB en todas las especies donde se encontraron (Fig. S2). Nuestros análisis también revelan que algunas especies tienen conjuntos ampliados de genes POP, incluidos algunos que están estrechamente relacionados con POPB (Fig. S2), lo que sugiere la expansión de la familia de genes POP como otro objetivo para futuras investigaciones. Un subclado pequeño y de divergencia temprana dentro del clado POPB más grande contiene una única secuencia de Amanita brunnescens (Fig. S2). Todas las demás especies con representantes en este subclado tienen secuencias POPB adicionales que anidan dentro del clado POPB más grande (p. ej., A. phalloides tiene dos supuestas secuencias POPB), lo que genera dudas sobre la funcionalidad de estos genes. Se necesita más trabajo para aclarar las funciones potenciales y la evolución de los genes POP en genomas sin secuencias MSDIN.

a Un gráfico UpSet que muestra la superposición en las secuencias centrales de MSDIN entre especies según nuestros análisis y los resultados publicados anteriormente (Tablas S2 y S4). El tamaño del conjunto refleja el número total de secuencias centrales únicas de MSDIN informadas para todos los genomas de una especie; Las diferencias en esta métrica deben interpretarse con cautela porque las especies pueden diferir en el número de genomas disponibles. El tamaño de la intersección representa los MSDIN presentes en las especies marcadas con un círculo negro sólido debajo de cada columna (p. ej., Amanita bisporigera tiene 26 MSDIN que no se encuentran en otras especies; el MSDIN IWGIGCNP (α-amanitina) se encuentra en todas las especies excepto Clavaria fumosa y Amanita polypyramis). Los MSDIN identificados a partir de estudios publicados no fueron revalidados. b Relaciones filogenéticas de especies productoras de MSDIN en Agaricales determinadas a partir del consenso de 289 árboles de máxima probabilidad de secuencias de proteínas de ortólogos de copia única (es decir, BUSCO). Las longitudes de las ramas terminales no se calculan. Todos los nodos que separan especies tienen probabilidades posteriores superiores a 0,93. La presencia de la enzima de procesamiento asociada a MSDIN, POPB, y los recuentos de secuencias de MSDIN se representan en los anillos interior y exterior (respectivamente). Si bien buscamos MSDIN en 249 genomas (Tabla S3), el árbol solo incluye familias taxonómicas con especies que tienen al menos un MSDIN y POPB. Los genomas que tienen genes MSDIN y POPB están resaltados con una estrella, donde el tamaño de la estrella también refleja el recuento total de MSDIN encontrado en cada especie. † Estas secuencias MSDIN están asociadas con productos maduros con bioactividad caracterizada como toxinas. De izquierda a derecha: faloidina (AWLATCP), falacidina (AWLVDCP), β-amanitina (IWGIGCDP) y α-amanitina (IWGIGCNP). * El genoma de Amanita brunnescens, una especie sin MSDIN, codifica una secuencia que se encuentra en un subclado POPB pequeño y de divergencia temprana (Fig. S2). Se necesita más trabajo para aclarar si este gen es funcional.

De acuerdo con nuestro descubrimiento de los genes POPB, los genomas de A. polypyramis y C. fumosa codifican cada uno de ellos un único MSDIN no identificado previamente (MSDINATRLP FLPPILP HYAPDDVNYTMLSDSLC y MFDTNDTRVP NWAGFFGWP CSPDTAGDTLNRGKDLC, respectivamente) (Fig. 4). Consideramos que la identificación de un segundo MSDIN putativo en el genoma de A. polypyramis (MSNVNATRIP GPRPLAFP FFGDEENNALNCGESLC) no es concluyente debido a la secuencia de baja calidad en su región central y seguidora. Si bien a ambos genomas parece faltarles el gen canónico de α-amanitina, su aparente ausencia puede deberse a ensamblajes genómicos incompletos.

Se ha informado que el gen α-amanitina es el único MSDIN en L. venenata [40], pero en su libro, Walton [33] informó seis genes MSDIN en Lepiota subincarnata. Identificamos dos secuencias MSDIN adicionales (MSDANNTRLP FFVPGLPFPP WTGENADHILARSKDLC y MSDANNTRLP FFAPGLPFPP WTGENADHILARSKDLC) en el genoma publicado [40] de L. venenata (Fig. 4), además del gen de α-amanitina (MDANATRLP IWGIGCNP WTPESVNDTLTKDLS). Estas secuencias también fueron identificadas por Luo et al. [38], y al analizar correctamente los intrones, nuestros resultados han resuelto secuencias seguidoras. Una cuarta secuencia MSDIN (MSDLNNTRLP VVTVLFTPPP WSGESVDHSLTRSKDLC) ubicada dentro de 2 kb de estas secuencias solo se encontró al aumentar el posible parámetro de rango de intrones de nuestros scripts en 30 pb. No está claro si la longitud larga del intrón de este MSDIN es biológicamente relevante o si este resultado refleja un error de secuenciación, ya que hay un tramo de ~30 pb de secuencia de baja calidad dentro de los datos de secuencia correspondientes. Nuestro hallazgo enfatiza la utilidad de nuestro proceso automatizado de búsqueda de MSDIN. Puede identificar MSDIN a gran escala y reconocer secuencias previamente pasadas por alto.

La evolución dinámica de los genes de toxinas entre los límites de muerte en California y Europa sugiere que la toxicidad y la presencia o ausencia de MSDIN no son neutrales: diferentes individuos poseen diferentes conjuntos de genes, los genes dan como resultado fenotipos mensurables y al menos algunas secuencias (incluida la secuencia que codifica el paradigmático MSDIN α-amanitina) experimentan una fuerte selección natural. Las continuas expansiones de distribución [75] enfatizan la necesidad crítica de comprender el papel ecológico de las toxinas producidas por el hongo en hábitats nativos e invadidos. Nuestro proceso bioinformático de búsqueda MSDIN aclara patrones no solo dentro de A. phalloides, sino también en los Agaricales, creando una base sólida para experimentos futuros, incluidas pruebas de las hipótesis tanto de “liberación del enemigo” [76] como de armas novedosas [31]. .

Los péptidos cíclicos y compuestos estructuralmente análogos similares a las toxinas que se encuentran en los casquetes mortales están presentes en los venenos de varias especies animales, incluidos los caracoles cónicos, las serpientes y las arañas [33], un ejemplo sorprendente de evolución convergente. En los animales, la diversificación del veneno a menudo se atribuye a presiones selectivas impuestas por las susceptibilidades diferenciales de diversas presas a toxinas específicas [77, 78], y la cantidad de componentes del veneno se asocia con la amplitud de la dieta [79]. Nuestros datos sugieren una dinámica similar para las presiones selectivas que actúan sobre los genes MSDIN (Fig. 2). Si bien las regiones líder y seguidora de la familia de genes MSDIN de A. phalloides se encuentran bajo una fuerte selección purificadora, las regiones centrales se están diversificando. Las regiones centrales están tan diversificadas que no pudimos alinear secuencias y aclarar si la diversidad resulta de una evolución neutral o de una selección positiva. Si bien las secuencias centrales como grupo son diversas, algunas secuencias centrales se conservan en todos los géneros (Fig. 4a), por ejemplo, la α-amanitina. Una fuerte selección purificadora actúa claramente sobre la secuencia que codifica la α-amanitina (Fig. 2). Los constituyentes del genoma accesorio pueden mantenerse mediante presiones selectivas relativamente raras o distribuidas de manera inconsistente, mientras que los constituyentes del genoma central pueden reflejar presiones selectivas generalizadas que se encuentran en todo el rango del límite de muerte. Se cree que las frecuencias alélicas de los genes que codifican el veneno en las serpientes son adaptativas en algunas poblaciones, lo que impulsa la diversificación del veneno mediante la selección equilibrada entre grupos [80]. Especulamos que la selección en MSDIN resulta de la interacción entre productos genéticos específicos (es decir, redundancia, sinergia y dependencia de la densidad) y la adaptación a las condiciones ecológicas locales (por ejemplo, poblaciones de fungivoros). Sin embargo, si bien el genoma central de MSDIN comprende la mayoría de las notorias toxinas MSDIN, la bioactividad de la mayoría de las MSDIN centrales y accesorias sigue siendo desconocida; un subconjunto de MSDIN puede no tener función ecológica [81]. Hasta que se defina la función de los MSDIN en la naturaleza, una comprensión holística de su evolución seguirá estando fuera de nuestro alcance.

La historia evolutiva de los MSDIN entre los hongos Agaricales (Figs. 3 y 4) también ofrece sorprendentes paralelismos con la evolución de los nudos, un grupo de compuestos similares a las cicloamanidas en los venenos de araña. Se cree que un ancestro común de los nudos ha experimentado múltiples eventos de diversificación independientes entre las especies de arañas [82]. De manera similar, la distinta agrupación de secuencias de MSDIN de diferentes géneros (pero observamos la excepción de las secuencias de α-amanitina de L. venenata y G. marginata) sugiere que la diversificación de MSDIN ocurrió de forma independiente en Lepiota y Amanita (Fig. 3). Se ha sugerido la duplicación de genes y la posterior selección positiva para la diversificación de nudos [83]. Los genes MSDIN estrechamente relacionados están físicamente cerca unos de otros dentro de los genomas (Fig. 3), lo que sugiere la duplicación y la divergencia posterior como un mecanismo que impulsa la generación de nuevos genes también en Amanita [84]. Se supone que el ancestro común de los nudos tuvo un enlace disulfuro que le confiere una potente bioactividad [82]. De manera similar, la potencia de la α-amanitina se atribuye a un enlace triptationina entre cisteína y triptófano; Se sugiere que la α-amanitina es ancestral de todas las secuencias MSDIN conocidas [33]. Tanto en los nudos como en los MSDIN, los puentes químicos no están presentes en todos los descendientes de las toxinas ancestrales. Nuestros resultados resaltan los notables paralelismos entre hongos y animales, ilustrando trayectorias comunes en las historias evolutivas de compuestos evolucionados de manera convergente pero estructuralmente similares.

Walton (2018) sugiere la distribución discontinua de los genes MSDIN en Agaricales spp. (Fig. 4) es el resultado de la transferencia horizontal de genes (THG), ya que la hipótesis alternativa de una pérdida extensa de genes es difícil de conciliar con las fuertes bioactividades de los genes. Entre Amanita spp., los genes MSDIN sólo se han descrito dentro del clado monofilético de la letal Amanita [85]. Nuestro hallazgo de un gen POPB y un gen MSDIN en el genoma de A. polypyramis (una especie fuera del letal clado Amanita) retrasa sustancialmente el momento en que los MSDIN se transfirieron a Amanita, lo que requiere una mayor inferencia de la pérdida de genes (o una pérdida incompleta). clasificación de linaje), o sugiere la aparición de una HGT adicional entre A. polypyramis y otro organismo. El MSDIN de A. polypyramis anida dentro del clado Amanita de secuencias MSDIN (Fig. 3), lo que sugiere que esta secuencia puede haber evolucionado en algún momento después de que comenzara la letal expansión de la familia de genes Amanita. La agrupación del MSDIN de A. polypyramis con otros MSDIN de Amanita es filogenéticamente incompatible con la historia evolutiva del género (Figs. 3 y 4), lo que apunta a un evento HGT dentro de Amanita, aunque enfatizamos los valores de soporte de arranque para su posición y la Las secuencias cortas subyacentes a la filogenia dejan abierta la posibilidad de que las verdaderas relaciones entre estos MSDIN sean congruentes con la transmisión vertical. Las relaciones filogenéticas inferidas de la secuencia más larga de la proteína POPB son compatibles con la transmisión tanto vertical como horizontal dentro del género, porque una transferencia a A. polypyramis podría haber ocurrido antes de la especiación del mortal clado amanita (Fig. S2). Las relaciones filogenéticas de los genes MSDIN y POPB que se encuentran en C. fumosa son filogenéticamente compatibles con nuestro árbol de especies, lo que sugiere que los genes pueden tener orígenes más antiguos de lo que se pensaba anteriormente (Fig. S2). Se necesitan más datos para aclarar las preguntas que plantean nuestros resultados sobre las historias evolutivas de los genes MSDIN y POP.

Los complejos ciclos de vida, la ploidía y las dificultades técnicas asociadas con el cultivo y la manipulación de basidiomicetos en el laboratorio han ralentizado el desarrollo de herramientas para identificar SM de basidiomicetos, lo que impide la experimentación dirigida. Un estudio reciente del reino fúngico enfatiza a Basidiomycota como un filo que alberga un conjunto único de compuestos similares a fármacos poco estudiados [86]. Nuestro proceso bioinformático de búsqueda MSDIN permite la prospección de fármacos dentro de una clase previamente inaccesible de SM específico de basidiomicetos y ofrece una hoja de ruta para el desarrollo de procesos similares en el futuro.

Los datos de secuencia de todos los especímenes de A. phalloides utilizados aquí están disponibles a través de Wang et al. [45]. Los datos de todos los demás análisis ya son públicos y están debidamente referenciados en el texto con detalles de números de acceso específicos disponibles en los Materiales complementarios.

Los scripts asociados con nuestro proceso bioinformático de búsqueda de MSDIN también están disponibles en los Materiales complementarios.

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Nuestra investigación fue posible gracias al trabajo pionero del Dr. Jonathan Walton (1953-2018), y le dedicamos nuestro artículo. También agradecemos el apoyo del Programa de Capacitación Postdoctoral en Toxicología Molecular y Ambiental de la Universidad de Wisconsin-Madison (UW), financiado por la subvención T32 ES007015 de los NIH (otorgada a MTD), los Institutos Nacionales de Salud R01 2R01GM112739-05A1 a NPK y la Beca Fulbright US Scholar para AP. La secuenciación genómica fue posible gracias a los fondos de una subvención RGP0053 del Programa de Ciencias de la Frontera Humana otorgada a AP. Esta investigación se realizó utilizando los recursos computacionales y la asistencia de la Universidad de Wisconsin: Centro Madison para Computación de Alto Rendimiento (CHTC) en el Departamento de Ciencias de la Computación; Agradecemos especialmente el atento y paciente apoyo de Christina Koch. Agradecemos a Sarah Friedrich su buen ojo y su ayuda con la representación de las figuras. Los autores utilizaron la instalación de secuenciación de ADN del Centro de Biotecnología Madison de la Universidad de Wisconsin (Identificador de recursos de investigación – RRID:SCR_017759) para preparar y secuenciar bibliotecas de ADN genómico. La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación tiene únicamente el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o respaldo por parte del Departamento de Agricultura de EE. UU. El USDA es un proveedor y empleador que ofrece igualdad de oportunidades.

Milton T. Rey

Dirección actual: Laboratorio de Enfermedades de Cereales del USDA-ARS, St. Paul, MN, EE. UU.

Departamento de Microbiología e Inmunología Médica, Departamento de Bacteriología, Universidad de Wisconsin, Madison, WI, EE. UU.

Milton T. Drott, Sung Chul Park y Nancy P. Keller

Departamentos de Botánica y Bacteriología, Universidad de Wisconsin, Madison, WI, EE. UU.

Yen-wen Wang, Lynn Harrow y Anne Pringle

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Conceptualización: MTD, AP. Experimentación: MTD, SCP, YW. Análisis de datos: MTD, SCP. La financiación fue obtenida por AP, MTD y NPK. MTD escribió el manuscrito con revisiones de AP y aportes de SCP, YW, LH y NPK. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Milton T. Drott, Nancy P. Keller o Anne Pringle.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Drott, MT, Park, SC, Wang, Yw. et al. La pangenómica del hongo de la muerte Amanita phalloides y de los Agaricales revela la evolución dinámica de los genes de las toxinas en un rango invasivo. ISME J 17, 1236–1246 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01432-x

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Recibido: 10 de diciembre de 2022

Revisado: 01 de mayo de 2023

Aceptado: 04 de mayo de 2023

Publicado: 23 de mayo de 2023

Fecha de emisión: agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01432-x

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